DLin系列

本實驗中，研究人員采用了一種合理的方法來設計陽離子脂質(zhì)，并制備用于遞送小干擾RNA（siRNA）的配方。以穩(wěn)定核酸脂質(zhì)顆粒（SNALP）的關鍵脂質(zhì)成分1，2-二甲醇氧基-3-二甲基氨基bing烷（DLinDMA）為例，研究人員利用所提出的可電離陽離子脂質(zhì)的體內(nèi)作用機制來指導設計具有優(yōu)異遞送能力的基于DLinDMA結(jié)構拓展的脂質(zhì)。通過篩選后，對性能好的脂質(zhì)（DLin-KC2-DMA），進行了SNALP配制和表征，并在嚙齒類動物和非人靈長類動物中分別在低至0.01 mg/kg和0.1 mg/kg的siRNA劑量下，證明具有體內(nèi)活性。研究發(fā)現(xiàn)，DLin-KC2-DMA介導的基因沉默比以前關于體內(nèi)內(nèi)源性肝臟基因沉默的報道有了實質(zhì)性的改進。

表1.1 基于DLin-DMA的結(jié)構設計

圖1.1. 新型陽離子脂質(zhì)的體內(nèi)評價

（a）. DLinDAP的沉默活性(▼), DLinDMA(▲), DLin-K-DMA(■) 和DLin KC2-DMA（●）在小鼠FVII模型中的篩選。所有LNP siRNA系統(tǒng)都是使用預成型囊泡（PFV）方法制備的，由可電離的陽離子脂質(zhì)、DSPC、膽固醇和PEG脂質(zhì)（40:10:40:10mol/mol）組成，F(xiàn)VII siRNA/總脂質(zhì)的比例約為0.05（wt/wt）。
（b）. 頭群擴展對DLin-K-DMA活性的影響。DLin-K-DMA（■）在DMA頭基和縮酮環(huán)連接體之間添加了額外的亞甲基，以生成DLin-KC2-DMA（●），DLin-KC3-DMA（▲）和DLin-KC4-DMA（▼）在小鼠因子VII模型中評估每種脂質(zhì)的制劑活性。

表1.2 含有新型脂質(zhì)的LNPs的生物物理參數(shù)和體內(nèi)活性

鑒于正電荷在指導脂質(zhì)設計的作用機制假說中的重要性，在DLin-K-DMA作為新的基準脂質(zhì)的綜述中研究了胺基頭基結(jié)構變化的影響。進行了一系列頭基修飾、表征和測試，以探索大小、酸離解常數(shù)和可電離基團數(shù)量的影響（補充合成2和補充表2）。所測試的pai嗪基、ma啉基、三甲基氨基或雙二甲基氨基修飾并不優(yōu)于DLin-K-DMA的基準二甲基氨基頭基。作為附加參數(shù)，通過引入額外的亞甲基來改變二甲基氨基和二氧wu環(huán)連接體之間的距離。該距離可以影響胺頭基的pKa以及電荷呈現(xiàn)相對于脂質(zhì)雙層界面的距離和柔性。相對于DLin-K-DMA，將單個額外的亞甲基插入頭部基團（DLin-KC2-DMA）產(chǎn)生效力的顯著增加。在FVII模型中，這種脂質(zhì)的ED50約為0.1 mg/kg，使其效力比DLin-K-DMA高4倍，比DLinDMA基準高10倍。然而，具有額外亞甲基的系鏈的進一步延伸顯著降低了活性，DLin-KC3-DMA的ED50約為0.6 mg/kg，DLin-KC4-DMA的ED50>3 mg/kg。

圖1.2. 基于DLin-K-DMA，延長頭部基團碳鏈長度對粒徑及ED50的影響

圖1.3. KC2-SNALP對嚙齒類動物和非人類靈長類動物的療效

（a） 相對于在小鼠中測試的初始篩選制劑，KC2-SNALP的療效得到改善。KC2-SNALP的體內(nèi)療效(○) 與小鼠因子VII模型中未優(yōu)化的DLin-KC2-DMA篩選（即PFV）制劑（●）的結(jié)果進行比較。數(shù)據(jù)點以PBS對照動物的百分比表示，代表組平均值（n=5）±s.d.（b）KC2-SNALP在非人靈長類動物中的療效。食蟹猴（每組n=3）接受0.03、0.1、0.3或1 mg/kg siTTR，或1 mg/kg在KC2-SNALP或PBS中配制的siApoB的總劑量，通過頭靜脈靜脈輸注15分鐘（5 ml/kg）。給藥后48小時對動物實施an樂死。在肝臟樣品中測定TTR mRNA水平相對于GAPDH mRNA水平。數(shù)據(jù)點代表組平均值±s.d.*，P<0.05；**，P＜0.005。

表1.3 含有KC2的SNALP的體內(nèi)活性

總結(jié)，研究人員將一種合理的方法應用于新型陽離子脂質(zhì)的設計，這些脂質(zhì)被篩選用于基于LNP的siRNA遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)結(jié)構分為三個主要功能元件：烷基鏈、連接基和頭基。以DLinDMA為起點，通過保持其他兩個元素不變，以系統(tǒng)的方式研究了這些元素中每一個的影響。首先，建立了烷基鏈，然后改變了連接體，最后，探索了不同的頭基結(jié)構。使用這種方法，描述了可離子化陽離子脂質(zhì)的重要結(jié)構-活性考慮因素，并鑒定了相對于DLinDMA基準具有改進活性的脂質(zhì)。性能好的脂質(zhì)（DLin-KC2-DMA）的SNALP制劑在嚙齒類和非人類靈長類動物中都具有良好的耐受性，并且在嚙齒類動物中在低至0.01mg/kg的siRNA劑量下表現(xiàn)出體內(nèi)活性，并且在非人類靈長目動物中表現(xiàn)出治療顯著基因（TTR）的沉默。盡管目前的工作范圍僅限于體內(nèi)肝臟遞送，但與之前關于LNP siRNA介導的非人靈長類動物沉默的報道相比，這項工作中實現(xiàn)的TTR沉默（ED50～0.3 mg/kg）代表了活性的顯著提高

試驗2

MC3最大限度地提高siRNA脂質(zhì)納米顆粒在體內(nèi)用于肝臟基因沉默的效力[2]

pKa的考察

圖2.1.TNS熒光法測定pKa

如圖2所示，四種可電離陽離子脂質(zhì)的pKa的測定實例。pKa的取值，定義為在一半最大熒光強度下的pH值。(A). 14，pKa=4.17；(B). 52，pKa=5.73；(C). 19，pKa=6.95；(D). 48，pKa=8.12。

圖2.2. 小鼠體內(nèi)肝臟基因沉默活性與pKa的關系圖

將56個可電離陽離子脂質(zhì)配制成LNP，并進行ED50分析，根據(jù)它們的pKa，繪制得到圖4。有15種脂質(zhì)，沒有達到ED50劑量。剩余的脂質(zhì)，通過最佳擬合曲線突出顯示了具有活性的化合物，其表現(xiàn)出在6.2和6.5之間的最佳pKa

表2.1. 56種可電離陽離子脂質(zhì)的設計及其ED50，pKa值考察

圖2.3. 小鼠肝臟基因沉默活性圖

pKa在4-8.5之間，計算質(zhì)子化/未質(zhì)子化可電離陽離子脂質(zhì)的電離程度（%摩爾分數(shù)）。每個FVII ED50數(shù)據(jù)點（藍色）來源于四劑量反應（每個劑量水平n=4只小鼠）。假設pH為7.4，在血液中攜帶正電荷的陽離子脂質(zhì)顯示為紅色，而在pH為5.5的酸性內(nèi)涵體中不帶電的陽離子脂質(zhì)的顯示為綠色。

圖2.4.支持pKa值作為決定可電離陽離子脂質(zhì)，體內(nèi)肝臟基因沉默活性的主導因素。

可電離陽離子脂質(zhì)15、16和17的混合物使所得LNP的平均表面pKa值在5.64和6.93之間遞增移位。括號中的數(shù)字表示混合物中陽離子脂質(zhì)的摩爾比（氨基脂質(zhì)組分）。

圖2.5.可電離陽離子脂質(zhì)（16，DLin-MC3-DMA）的siRNA-LNP在小鼠和非人類靈長類動物中的功效。

在本研究中使用了含有50摩爾%的16（DLin-MC3-DMA）的經(jīng)過優(yōu)化后的制劑組合。相對于具有約0.005 mg.kg-1的中值有效siRNA劑量（ED50）的生理鹽水對照組，小鼠血清中的殘余FVII活性；柱狀圖代表平均值（n＝5）給予食蟹猴0.03、0.1和0.3mg.kg-1劑量的靶向TTR基因的siRNA。線型圖則表示平均值（n=3），以TTR mRNA表示，相對于肝臟樣本中測定的GAPDH mRNA水平，ED50估計為<0.03 mg.kg-1。

Reference

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